在細(xì)胞傳代培育過(guò)程中的原則、注意事項(xiàng)

在生物醫(yī)學(xué)試驗(yàn)中常常會(huì)用到細(xì)胞系，指原代細(xì)胞培育物經(jīng)傳代成功后所繁衍的細(xì)胞群體。也指可長(zhǎng)期連續(xù)傳代的培育細(xì)胞。細(xì)胞系是經(jīng)過(guò)細(xì)胞傳代或續(xù)代培育是將細(xì)胞從現(xiàn)有的培育物分隔或分出來(lái)開(kāi)端新的培育，并參加新鮮培育液來(lái)促進(jìn)擴(kuò)增的常用手法。可是細(xì)胞系與新分離的或原代細(xì)胞的培育條件相類似，但也有一些根本不同的當(dāng)?shù)兀?br />
（1）每個(gè)細(xì)胞系需求其特定的成長(zhǎng)因子混合物

（2）與原代細(xì)胞比較，它們的成長(zhǎng)需求更嚴(yán)密的監(jiān)測(cè)，由于使它們無(wú)限成長(zhǎng)的突變同時(shí)也會(huì)形成它們很快到達(dá)過(guò)度成長(zhǎng)。因而，當(dāng)細(xì)胞系成長(zhǎng)到了簡(jiǎn)直覆蓋整個(gè)培育器皿底部，也便是90%的密度時(shí)，細(xì)胞需求重懸洗滌用于試驗(yàn)或凍存以備將來(lái)運(yùn)用，或許重新接種到新的培育器皿進(jìn)一步擴(kuò)增。

細(xì)胞換液注意事項(xiàng)：

首要要注意細(xì)胞培育液的色彩，富含營(yíng)養(yǎng)的新鮮培育液由于添加了pH指示劑酚紅故為透明橙色。當(dāng)細(xì)胞耗盡培育液中的營(yíng)養(yǎng)成分時(shí)，開(kāi)端在培育物中堆集廢物和酸性物質(zhì)，下降pH值。因而，許多細(xì)胞培育液含有酚紅，當(dāng)培育物呈酸性時(shí)會(huì)將培育液色彩由橙色變?yōu)椤Ｅ嘤盒柙谧凕S之前替換。當(dāng)酚紅變?yōu)榉奂t色時(shí)，說(shuō)明培育基pH偏堿，不利于細(xì)胞健康成長(zhǎng)。這時(shí)或許需求改變二氧化碳濃度并替換培育液。許多貼壁細(xì)胞系可天然附著于無(wú)涂層的塑料上。

因而，塑料細(xì)胞培育板如培育皿或六孔板常常用于傳代細(xì)胞。塑料的細(xì)胞培育瓶也常常用到，如T25的細(xì)胞培育瓶，常用于擴(kuò)增培育數(shù)目少的細(xì)胞或許開(kāi)端培育成長(zhǎng)緩慢的細(xì)胞系。T75細(xì)胞培育瓶常用在培育擴(kuò)增速度較快的細(xì)胞系或用于成長(zhǎng)超越T25培育瓶容量的很多細(xì)胞。在搬運(yùn)貼壁細(xì)胞時(shí)，要先剪切掉細(xì)胞上與和塑料結(jié)合的蛋白。因而，消化酶胰酶常用于消化細(xì)胞。控制胰酶消化的時(shí)間很重要，由于假如處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)損壞細(xì)胞外表的蛋白。細(xì)胞培育液能中和胰酶。

所以在胰酶消化前常用磷酸緩沖液或PBS洗滌細(xì)胞。EDTA，一種鈣螯合劑有時(shí)候也用于提高胰酶的蛋白水解功能。為擴(kuò)增細(xì)胞克隆，將新鮮傳代的細(xì)胞培育于細(xì)胞培育箱中，挑選適合該細(xì)胞成長(zhǎng)條件，一般為溫度37度，二氧化碳5％和濕度95%。

傳代的不同運(yùn)用：

人胚胎干細(xì)胞是一類有必要傳代的細(xì)胞。它們一般與小鼠成纖維細(xì)胞MEF共培育，后者能供給協(xié)助干細(xì)胞堅(jiān)持其多能性的因子。成善于養(yǎng)殖細(xì)胞上的干細(xì)胞到了適宜的發(fā)育階段時(shí)需挑出來(lái)。可用微型移液管挑出或用玻璃工具輕輕將其刮下然后接種于新的培育液中進(jìn)行擴(kuò)增。有一些細(xì)胞系對(duì)酶消化靈敏，或許貼壁很緊無(wú)法運(yùn)用胰酶處理來(lái)重懸。細(xì)胞刮常用來(lái)輕輕將細(xì)胞從培育板的底部刮下來(lái)。假如細(xì)胞貼壁特別緊，可參加培育液或恰當(dāng)溶液后用血清吸管用力刮擦。運(yùn)用該方法時(shí)要當(dāng)心，細(xì)胞比較脆弱，容易在這種機(jī)械剝離的方法中受損。為了更快并可重復(fù)性的很多擴(kuò)增細(xì)胞到超越單層培育瓶容量的規(guī)模，可以運(yùn)用多層培育瓶，它的培育量可達(dá)單層培育瓶的3-5倍。

細(xì)胞傳代的操作步驟

首要，重要的是要清楚細(xì)胞需求監(jiān)測(cè)的頻頻程度，這取決于該細(xì)胞的擴(kuò)增速度。現(xiàn)在培育液為亮橙色，再觀察其它成長(zhǎng)情況。如培育液是否污濁-如污濁則或許有污染, 細(xì)胞的巨細(xì)和密度以及細(xì)胞的整體質(zhì)量。假如細(xì)胞密度到達(dá)90%，吸去細(xì)胞培育液，用無(wú)鈣離子和鎂離子的磷酸緩沖液洗滌。然后參加胰酶，置于37攝氏度約5分鐘，承認(rèn)細(xì)胞脫壁后，參加新鮮細(xì)胞培育液停止胰酶的水解。將懸浮的細(xì)胞搬運(yùn)到錐形管離心。細(xì)胞離心下來(lái)后，當(dāng)心棄去上清，重懸細(xì)胞于新鮮培育液。計(jì)數(shù)收集到的細(xì)胞然后依據(jù)適宜密度接種細(xì)胞當(dāng)即進(jìn)行擴(kuò)增或用于將來(lái)擴(kuò)增。