酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）操作步驟

 ELISA檢測(cè)系統(tǒng)可謂是免疫學(xué)反應(yīng)應(yīng)用到科研生產(chǎn)中為廣泛為靈敏的技術(shù)手段。下面小編簡(jiǎn)單介紹一下酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）操作步驟。詳細(xì)步驟如下：

1.用靶蛋白（稀釋于 50 mM 碳酸鹽緩沖液 PH 9.0）包被反應(yīng)板。濃度應(yīng)該做滴度來(lái)獲得。但對(duì)于純化的抗原在1μg／ml濃度，每孔 50 μl一般情況下足夠。用薄膜覆蓋4oC孵育過(guò)夜。

2.移去抗原溶液。加入封閉液200μl／孔（PBS containing 1% BSA ａnd 0.02% azide）以封閉非特異蛋白的結(jié)合。室溫下卵育1–2小時(shí)，或4oC過(guò)夜。

3.移去封閉液。用PBS漂洗一次。濕潤(rùn)的反應(yīng)板（孔）在密封塑料袋中4oC下可保存4周。使用移去多余液體。

4.加入用封閉液稀釋的檢測(cè)抗體和對(duì)照 50 μl／每孔。抗體可以做一個(gè)系列稀釋以確定一個(gè)滴度或者用以曾經(jīng)用于篩選試驗(yàn)的濃度，以及根據(jù)抗原含量滴度。室溫下孵育一小時(shí)。

5.用含0.05%Tween-20（Tween-20: sc-29113）PBS沖洗培養(yǎng)板3次。吸去多余的液體。

6.每孔加入50μl用封閉緩沖液稀釋 1:100-1:1000 倍的堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗 （ WB 用常規(guī)二抗）抗體濃度應(yīng)通過(guò)滴度來(lái)獲得。室溫下孵育1小時(shí)。

7.移去孔內(nèi)液體。用含0.005%Twenn-20PBS沖洗3次并風(fēng)干。

8.用二乙醇胺緩沖液 （10 mM diethanolamine, 0.5 mM MgCl2 （pH 9.5） 沖洗培養(yǎng)孔并移去液體。

9.用二乙醇胺緩沖液（diethanolamine buffer）稀釋底物（PNPP, sc-3720），終濃度為1mg/ml。每孔加入50μl。反應(yīng)10–20分鐘或陽(yáng)性對(duì)照的405／490 吸光度約為1.0。加入50μl0.1MEDTA（EDTA: sc-29092），PH 7.5。酶標(biāo)儀讀取405／490 nm 光吸收值。

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