蛋白質結構解析的方法

   到目前為止，蛋白質結構解析的方法主要是兩種，x射線衍射和NMR。近年來還出現了一種新的方法，叫做Electron Microscopy。其中X射線的方法產生的更早，也更加的成熟，解析的數量也更多，我們知道，*個解析的蛋白的結構，就是用x晶體衍射的方法解析的。而NMR方法則是在90年代才成熟并發展起來的。這兩種方法各有優點和缺點。

   這兩種方法的一般的步驟和各自的優點和缺點。電子顯微鏡（electron microscopy）作為一種新型的技術，目前的應用還是非常少，并且比較狹窄，我可能等到zui后在給它作些介紹，而且相信絕大多數人也沒有聽說過，也不會有很大的興趣。

1.首先是X晶體衍射。首先要得到蛋白質的晶體。
   通常，都是將表達蛋白的基因PCR之后克隆到一種表達載體中，然后在大腸桿菌中誘導表達，提純之后摸索結晶條件，等拿到晶體之后，工作便完成的80％，將晶體進行x射線衍射，收集衍射圖譜，通過一系列的計算，很快就能得到蛋白質的原子結構。
用x射線的優點是：速度快，通常只要拿到晶體，甚至當天就能得到結構，另外不受大小限制，無論是多大的蛋白，或者復合體，無論是蛋白質還是RNA、DNA，還是結合了什么小分子，只要能夠結晶就能夠得到其原子結構。所以x射線方法解析蛋白的瓶頸是摸索蛋白結晶的條件。這個時候運氣就顯的特別重要。關于這個有好多有趣的離子。據說國外一個同學在摸索兩個月無果之后，毅然去度假，就將蛋白扔在一個很隨便的地方，等度假回來之后，卻發現已經結晶了。

2.NMR（nuclear magnetic resonance）現象早已發現了很久，然后將這種方法用來解析蛋白結構，卻是近一二十年的事情。不過到今天為止，用nmr方法來解析結構已經十非常成熟的方法。
原理暫且放在一邊，先說常規步驟。
首先通過基因工程的方法，表達出目的蛋白，提純之后，摸索一下蛋白穩定的條件，如果蛋白沒有聚合，而且折疊良好，便將蛋白樣品（通常是1mM－3mM，500ul，Ph6－7的PBS）裝入核磁管中，放入核磁譜儀中，然后用一系列寫好的程序控制譜儀，發出一系列的電磁波，激發蛋白中的H、N13、C13原子，等電磁波發射完畢，在收集受激發的原子所放出的“能量”，其實也是小磁場，通過收集數據、譜圖處理、電腦計算從而得到蛋白的原子結構。
它的優點就是，蛋白在液體中得到結構，是一個動態的結構，事實上所有在pdb中或者文獻中發表的NMR結構都是十個或者二十個結構的ensemble（集合），這就是因為這些結構都是進行能量優化后符合條件的結構，或者說就是溶液中的蛋白結構。因為是動態就很容易的研究蛋白與其他蛋白或者配基的相互作用。缺點是，受大小的限制，到目前為止NMR解析蛋白結構的上限是50kd。

   無論是晶體還是NMR，蛋白都要符合下面的條件：首先表達量要大，象NMR要求1個mM500UL，這就要求十幾個毫克，結晶要摸索很多的條件也需要大量的蛋白。所以蛋白一定要在胞質中表達才行。其次，蛋白要折疊。我們知道許多蛋白，尤其是真核蛋白在大腸桿菌中是以包含體的形式存在，這種情況下是不行的，除非復性。如果你的蛋白在胞質中表達，如果你不確定是不是表達，可以從分子篩上的位置，或者掃CD確定一下，當然zui簡單的是做一個NMR一維譜，只需要幾分鐘。
小于20Kd的蛋白可以考慮NMR，因為NMR研究功能核相互作用方面是更加擅長的，而且不需要結晶，現在速度也不慢。如果比較大，可以考慮晶體解析。

   對于用NMR來解析結構，zui重要的條件就是非常昂貴的核磁譜儀，以及同位素標記蛋白。只要采集了譜之后就算的得到了原始數據，其他的在電腦上通過專業的軟件處理就可以了。對于小分子蛋白不需要同位素標記，也不需要600、800MHz的譜儀，一般的400、500MHz的小型譜儀也可以做了，但是對于10K以上的蛋白，基本上就要用磁場更強的600、800Mhz的核磁譜儀。