免疫堿性磷酸酶組織化學(xué)技術(shù)

免疫堿性磷酸酶組織化學(xué)技術(shù)

免疫堿性磷酸酶組織化學(xué)技術(shù)是以堿性磷酸酶（AKP或AP）取代HRP來顯示結(jié)果的免疫酶組織化學(xué)技術(shù)。zui早出現(xiàn)的是間接免疫堿性磷酸酶法（1AP），1983年Mason及Moir等建立了堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶（APAAP）復(fù)合物法。隨后，人們建立了更為敏感的生物素—親和素—堿性磷酸酶復(fù)合物（ABC-AP）法、S-P堿性磷酸酶法、EnVision堿性磷酸酶法以及用于原位雜交檢測的抗地高辛（Dig）、抗生物素（biotin）和抗熒光素（FITC）—AKP檢測系統(tǒng)。因免疫堿性磷酸酶技術(shù)具有*優(yōu)點(diǎn)，如敏感的酶底物顯色系統(tǒng)、染色背景低，故應(yīng)用日益廣泛，尤其在原位雜交、TUNEL等的檢測。
 

一、間接免疫堿性磷酸酶法
此方法的基本原理與HRP-抗體間接法類似，體，將其制備成酶標(biāo)記抗體。其染色步驟如下。
（1）切片脫蠟至水，PBS洗3min×3次。所不同的是用AKP代替HRP標(biāo)記第
（2）蛋白酶消化或AR（組織抗原的暴露或抗原的修復(fù)，此步視情況而定）。
（3）滴加正常血清，阻斷20min（減少非特異性背景染色），吸去多余血清。
（4）滴加適當(dāng)稀釋的特異性一抗，37℃孵育30～60min或4℃過夜，PBS洗3min×3次。
（5）適當(dāng)稀釋的AKP標(biāo)記的二抗37℃孵育30～60min，PBS洗3min×3次。
（6）加入0．02mol／L（pH9．0）TBS（內(nèi)含lmmol／L左旋咪唑，5mmol／L MgClz）阻
斷內(nèi)源性堿性磷酸酶。
（7）切片上滴加50—100~1底物溶液（BCIP／NBT），室溫中濕盒內(nèi)避光顯色30min一48h，顯色30min后鏡下觀察，待陽性充分顯示后水洗終止反應(yīng)。
（8）充分水洗后用核固紅復(fù)染5min，沖洗后系列乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片。
（9）結(jié)果觀察，背景呈紅色，陽性產(chǎn)物呈紫藍(lán)色。
注：染色結(jié)果可根據(jù)不同的顯色底物而顯示不同顏色，如用堅(jiān)固紅（FR／AS-MX）產(chǎn)生的底物為玫瑰紅色，用堅(jiān)固藍(lán)（FB／AS-MX）則產(chǎn)物為紫綠色，而BCIP／NBT為紫藍(lán)色。特別要強(qiáng)調(diào)的是，F(xiàn)R／AS-MX和FB／AS-MX底物系統(tǒng)產(chǎn)生的顏色反應(yīng)產(chǎn)物，能溶于有劑溶，如乙醇、二甲苯，所以不能用樹膠封片。

二、APAAP法
APAAP法的原理與PAP法類似（見圖4—12），都屬于未標(biāo)記抗體橋聯(lián)法，所不同的是用AKP取代了HRP。該方法較IAP法敏感性高，特別是用于標(biāo)記固定過的組織，其染色步驟如下。
（1）～（4）步同IAP法。
（5）適當(dāng)稀釋橋抗體（二抗），37~C溫育30min或室溫中孵育60min。
（6）PBS洗3minX 3次。
（7）適當(dāng)稀釋APAAP復(fù)合物（與特異性一抗同屬），37℃溫育30min或室溫中孵育60min。
（8）PBS洗3minx 3次。
（9）底物顯色及復(fù)染、封片同IAP法。
注：特異性一抗和APAAP復(fù)合物中IgG必須來源于同一種屬動物，*抗體的稀釋度要較IAP法高（濃度低）。
APAAP法的主要優(yōu)點(diǎn)是非特異性背景染色較淺，因?yàn)槠洳皇軆?nèi)源性過氧化物酶的干擾，PAAP復(fù)合物所用的AKP是從小牛腸組織中提取，只存在于腸組織。同時，反應(yīng)底物溶液的左旋咪唑具有抑制非腸源性堿性磷酸酶活性的作用，且不影響APAAP復(fù)合物中腸源性KP的活性。因此，在檢測那些富含內(nèi)源性過氧化物酶的組織、冰凍切片及造血組織標(biāo)本時，PAAP法是一種很好的方法。
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